maladie des enfants-bulle

http://www.snv.jussieu.fr/vie/bib/dos-doc/1documents.htm 

La maladie des enfants-bulle est une maladie très rare : 5/100 000 naissances / année en France.

Elle
se manifeste par un déficit immunitaire sévère, qui condamne
les jeunes malades à vivre à l'abri des germes dans une atmosphère
stérile, d'abord à l'intérieur d'une bulle de plastique,
puis d'un local spécialisé (et d'un scaphandre pour leurs sorties).

Dans sa variante la plus connue, ce déficit est dû à la
présence sur le chromosome X d'une version mutée d'un gène
codant pour une protéine participant à la constitution du récepteur
de l'interleukine 2 (la sous-unité gamma-c) sur la membrane de certains
globules blancs. L'absence du récepteur complet rend impossible l'orchestration
entre eux des globules blancs lymphocytes T (LT), lymphocytes B (LB) et lymphocytes
Natural Killer (NK) par le moyen de l'interleukine 2.

Les garçons, qui
ne disposent que d'un seul chromosome X, deviennent ainsi sujets à toutes
les infections. La maladie des enfants-bulle est donc en fait, dans sa variante
la plus connue, la maladie des garçons-bulle ou "déficit
immunitaire combiné sévère lié au chromosome X"
(DISC-X, voir Fig. 1).

Les seules perpectives de soin pour ces petits garçons sont

• soit une
  greffe de moelle osseuse, tissu qui est à la source des globules blancs, mais les donneurs de moelle compatibles sont rares.
• soit une thérapie génique qui apporte le gène non muté, mais la thérapie génique
  est interrompue actuellement par des problèmes majeurs :

1999 - les premiers essais de thérapie génique, conduits
par l'équipe d'Alain Fisher à l'hopital Necker, débutent
par un spectaculaire succès - qui est aussi le premier jamais obtenu
par thérapie génique : dix enfants sont traités, et guérissent.
Les cellules souches de leurs globules blancs avaient été prélevées
dans leur moelle osseuse et traitées in vitro par un rétrovirus
désactivé qui ajoutait la version non mutée du gène
à leur génome porteur du gène muté. Ainsi complétées,
ces cellules souches avaient alors été réinjectées
dans la circulation sanguine des petits malades.

2002 - deux d'entre eux, qui avaient été
traités avant l'âge de trois mois, deviennent leucémiques.
L'un guérira, mais l'autre finira par en mourir. Les essais thérapeutiques
sont aussitôt suspendus. Dans les deux cas, le gène correcteur
s'est inséré au voisinage du même gène LMO-2 prédisposant
au cancer.

Les protocoles sont alors révisés : début du traitement
repoussé après l'âge de six mois, recours à des doses
plus faibles de cellules modifiées. Et les essais thérapeutiques
sont de nouveau autorisés en mai 2004.

2005 - un troisième cas de leucémie se déclare
en janvier chez un enfant traité à l'âge de neuf mois.
Les essais thérapeutiques sont une seconde fois suspendus. Le gène
médicament s'est à nouveau inséré auprès
d'un oncogène (qui n'est pas le LMO-2). Les essais ne reprendront à
Necker que lorsque le virus vecteur du gène salvateur aura pu être
modifié.

Parallèlement, en Grande-Bretagne les sept enfants traités selon
un protocole pratiquement similaire au premier protocole français sont
tous guéris. Cependant, le temps écoulé depuis le traitement
n'a pas encore atteint la durée à partir de laquelle les leucémies
françaises sont survenues. Enfin, des essais vont être conduits
pour la première fois aux Etats-unis. Ils s'adresseront aux enfants sur
lesquels une greffe de moelle osseuse a échoué ou n'a pu être
tentée.

C'est dans ce contexte qu'une nouvelle voie de thérapie génique
vient de commencer à être expérimentée. Cette nouvelle voie thérapeutique est due à Fyodor
D. Urnov et ses collaborateurs, de Sangamo BioSciences en Californie et
de l'Université Southwestern au Texas. Sa nouveauté fondamentale
est qu'elle opère par remplacement et non par addition, c'est à
dire que la portion mutée du gène a été précisément
remplacée par la version non mutée, sans toucher au reste du génome.
Dans le processus antérieur, la version non mutée du gène
était ajoutée à un génome qui demeurait porteur
de la version mutée d'origine.

Pour effectuer cette substitution, les chercheurs ont opéré sur
les LT prélevés chez les malades et ont réussi in vitro
l'admirable enchaînement suivant :

1. Détection du site précis de la mutation par des protéines
   en doigts de zinc.
2. Coupure de l'ADN ciblé par une enzyme (une endonucléase)
   préalablement liée à deux protéines en doigts
   de zinc.
3. Exploitation du mécanisme naturel de recombinaison homologue pour
   remplacer la portion du gène muté par la portion équivalente
   du gène non-muté.

Dans près de 20% des cas - un taux énorme pour une recombinaison
homologue, et un taux suffisant pour soigner plus tard les malades - la portion
d'ADN mutée des LT a été remplacée par sa version
non mutée. Le gène corrigé s'exprime sous forme d'ARNm,
puis de la protéine gamma-c permettant la bonne mise en place du récepteur
de l'interleukine 2. La correction s'effectue de façon rapide et se maintient
de façon durable.

Ultérieurement, ce ne sont pas les LT, LB ou NK que les chercheurs corrigeront
in vitro par cette méthode, mais leurs cellules souches progénitrices
logées dans la moelle osseuse qui bénéficient d'une longue
durée de vie. Une fois traitées, elles seront réinjectées
dans la circulation des petits patients pour pouvoir coloniser leur moëlle
osseuse.

Conclusion

Cette nouvelle voie de thérapie génique est riche de promesses
parce qu'elle pourrait, sans affecter le reste du génome, et sans risquer
notamment de perturber un oncogène, corriger de façon parfaitement
ciblée la version indésirable d'un gène. A la condition
toutefois que puisse être garantie l'absolue spécificité
de la méthode vis à vis du gène à corriger, ou encore
l'absence de réactions immunitaires provoquées par les protéines
en doigts de zinc qui sont les artisans de ce ciblage.

Il deviendrait alors possible d'étendre cette technique à d'autres
maladies, car c'est aujourd'hui toute une batterie de ces protéines en
doigts de zinc que les chercheurs savent fabriquer à la demande, et qui
sont à chaque fois capables de reconnaître une cible différente
: qu'il s'agisse du gène muté dans le cas d'autres maladies monogéniques,
comme par exemple l'anémie falciforme, ou qu'il s'agisse du gène
à faire muter, comme celui codant la porte d'entrée du virus du
Sida à l'intérieur des LT !

Les doigts de zinc (voir fig. 2A) sont des structures de reconnaissance de
l'ADN. En fonction de la nature des acides aminés qui les composent
(hors les cystéines et histidines liant l'atome de zinc), une séquence
spécifique d'ADN de trois nucléotides sera reconnue. En utilisant
deux protéines comportant chacune trois doigts de zinc pouvant être
individuellement choisis (voir fig. 2B), la reconnaissance s'effectue sur
une séquence spécifique de dix-huit nucléotides. Un rapide
calcul de probabilité établit qu'une séquence aléatoire
de dix-huit nucléotides n'a pratiquement aucune chance d'exister à
plus d'un exemplaire dans un génome de cinq miliards de nucléotides
correspondant au génome humain. En conséquence, par cette méthode
on peut cibler de manière spécifique et unique une séquence
d'intérêt connue (par exemple un gène muté...)

Figure 2A : schéma d'une structure en doigt de zinc. Un atome de zinc central stabilise le repliement de la protéine en établissant quatre liaisons avec deux résidus cystéine et deux résidus histidine. On trouve également des structures en doigt de zinc faisant intervenir quatre résidus cystéine. Source illustration : Wikipedia (article Zinc finger), dépendante de la Licence de documentation libre GNU.

Figure 2B : schéma d'une ZFN (Zinc Finger Nuclease). Chaque doigt de zinc reconnaît trois nucléotides spécifiques. Une protéine comportant trois doigts de zinc en tandem permet donc de reconnaître une séquence spécifique de neuf nucléotides. A ce domaine de reconnaissance, on a couplé le domaine endonucléasique de l'enzyme Fok I.

L'endonucléase utilisée (domaine endonucléasique de l'enzyme
Fok I) est non spécifique et agit sous forme dimérique. On utilise
donc deux protéines comportant chacune trois structures en doigt de
zinc reconnaissant des séquences éloignées de quelques
nucléotides. La liaison des deux protéines en doigts de zinc
sur leurs séquences respectives rapproche les deux endonucléases
qui leur sont associées. Ce rapprochement permet leur dimérisation
et par suite la coupure de la molécule d'ADN (voir fig. 3).

La courte molécule d'ADN non mutée, susceptible de remplacer
la fraction mutée à l'origine de la maladie, est ajoutée
aux deux molécules protéiques précédentes (voir
fig. 4). Si le phénomène de recombinaison homologue (largement
utilisée dans la technique d'inactivation de gène, plus connue
sous le nom de knok out) ne nécessite pas une coupure préalable
de l'ADN par endonucléase, son efficacité dans ces conditions
est très faible. Couper l'ADN permet d'augmenter considérablement
le taux de recombinaison homologue.

Figure 4 : la recombinaison homologue. La molécule d'ADN ajoutée comporte le gène non-muté à insérer encadré de séquences flanquantes identiques aux séquences qui bordent le site de coupure par l'endonucléase. La recombinaison se produit de façon spontané