SVTR

Les cellules souches - embryonnaires, foetales, adultes

Les cellules souches ont deux qualités que ne possèdent pas les
autres cellules : leur capacité à se multiplier indéfiniment
en culture in vitro, aussi longtemps qu'elles sont laissées dans
un état indifférencié; et leur aptitude à se différencier
dès lors que leur sont proposés des facteurs adéquats.

Elles existent chez l'embryon, chez le foetus et son cordon ombilical, ou chez
l'individu né - qu'on qualifie alors ... d'adulte.

Les cellules souches embryonnaires, localisées dans la masse cellulaire
interne du tout jeune embryon (voir schéma ci-dessous), sont exceptionnelles
en ce qu'elles participent à l'édification de tous les tissus
du futur individu. Cette totipotence les qualifient pour réparer
tous les tissus, et les rend aptes à livrer une information, pour l'instant
inégalée, sur le développement embryonnaire et son contrôle
génétique.

Pour leur part, les cellules souches foetales ou adultes, localisées
en petit nombre dans tous les tissus (dont elles assurent la maintenance), n'ont
pas une telle universalité : elles sont seulement multipotentes
même si elles se révèlent plus multipotentes qu'on
ne le pensait, comme l'étude des cellules souches du tissu adipeux l'a
montré.

Les atouts du tissu adipeux adulte

Le tissu adipeux est aisé à prélever par liposuccion, et
un individu, même mince, peut en livrer facilement un litre.

Il contient des cellules souches, qui ont l'intérêt de se multiplier
plus vite que celles obtenues à partir d'autres tissus adultes comme
la moelle osseuse ou le cerveau par exemple.

Ces cellules souches se différencient in vitro en cellules adipeuses,
mais aussi en cellules musculaires, osseuses et même en cellules nerveuses,
ce qui n'était pas attendu puisque les cellules nerveuses dérivent
de l'épiderme alors que les cellules adipeuses proviennent du mésoderme.

Chacun pourrait donc disposer de ces cellules pour une autogreffe réparatrice,
exempte de rejet. Et chacun pourrait les proposer, pour une allogreffe, à
qui serait porteur d'un défaut génétique interdisant l'autogreffe.

Les études préliminaires menées chez la souris ont ouvert
cette voie.

 

• Les avancées d'avril-juin 2004 chez la souris

Les chercheurs travaillant sur les cellules souches adultes du tissu adipeux
de souris ont, au cours de ce printemps, engrangé trois beaux succès
:

- la réparation de fracture

On savait conduire, in vitro, la différenciation de cellules
souches adipeuses de souris en cellules cartilagineuses et osseuses. Michael
Longaker et son équipe, de l'université de Standford en Californie,
sont parvenus à le faire in vivo sur des souris : ils ont pratiqué,
chirurgicalement, une fracture trop large pour se réparer toute seule
sur laquelle ils ont appliqué des cellules souches adipeuses adultes,
disposées dans un polymère biodégradable d'apatite (un
constituant naturel des os). Les fractures des souris témoins ne faisaient
pas l'objet d'un tel traitement.

Douze semaines plus tard, les cellules souches avaient comblé en se
différenciant 70 à 90% de la fracture des souris traitées.
Par comparaison, chez les souris témoins il n'était apparu qu'un
tissus désorganisé et qui plus est seulement dans moins de10%
des cas.

Pour l'instant, les essais cliniques pratiqués chez les humains, pour
tenter de réparer les fractures graves, n'utilisent que des cellules
souches provenant de la moelle osseuse.

- l'expression de protéines spécifiques du muscle cardiaque

On savait obtenir l'expression de protéines spécifiques du muscle
cardiaque (chaîne lourde de la myosine et troponine 1) à partir
de cellules souches adipeuses en culture in vitro. John Fraser et l'entreprise
de biotechnologie Macropore viennent de montrer qu'il était possible
de le faire in vivo : ils ont injecté chez des souris au myocarde
altéré, soit une simple solution saline, soit un million de cellules
souches adipeuses induites, c'est à dire auxquelles avaient été
fournis des facteurs de différenciation. Chez les souris du deuxième
groupe, et chez elles seules, le myocarde s'est mis à exprimer les deux
protéines spécifiques du muscle cardiaque.

- la différenciation, in vitro : vers des cellules
nerveuses

Les chercheurs savaient obtenir in vitro des cellules qui ressemblent
à des cellules nerveuses à partir de cellules souches adipeuses
et d'un cocktail de facteurs de croissance et d'agents inducteurs.

ces cellules fonctionnaient bien comme des cellules nerveuses
: elles expriment en effet des protéines spécifiques à
ces dernières comme des protéines réceptrices de neurotransmetteurs.

Ainsi, le NMDA, une substance mimétique du neurotransmetteur glutamate,
a la particularité de faire mourir les cellules nerveuses lorsqu'il est
présent en trop grande quantité en produisant chez elles, une
fois lié à leurs récepteurs au glutamate, un effet bien
trop excitateur. Or, le NMDA a le même effet mortel sur les cellules souches
induites ce qui démontre qu'elles reçoivent son message; donc
qu'elles expriment à leur surface les récepteurs NMDA du glutamate
capables de le capter.

L'étape suivante consistera à passer à l'étude
in vivo en introduisant dans un modèle animal de telles cellules
induites.

 

• Les
  perspectives

A la lumière de ces premiers résultats, il apparaît que
les cellules souches adultes du tissu adipeux, qui ont l'intérêt
d'être disponibles en quantité et de ne susciter aucun débat
éthique, sont promises à un bel avenir dans la reconstruction des
tissus dégradés ou perdus.

Ces résultats montrent aussi que les tissus auxquels on peut espérer
aboutir sont de types plus variés que ceux vers lesquels s'orientent
naturellement ces cellules, dès lors qu'on saura leur fournir les facteurs
de différenciation adéquats.

Mais, il existe des centaines de types de cellules différentes chez
l'homme, et il est fort peu probable que les seules cellules souches adipeuses,
ou même d'autres types de cellules souches adultes, suffiront pour obtenir
tous les types cellulaires . Un tel résultat ne semble accessible que
via un élargissement et une diversification des sources disponibles de
cellules souches.

C'est ainsi que la Grande-Bretagne vient de créer en mai 2004 une banque
de cellules souches accessible aux chercheurs du monde entier, qui accueillera
et stockera tous les types de cellules souches qu'on aura su isoler, qu'elles
soient : embryonnaires, foetales ou adultes.

Pour quelles recherches une telle banque de cellules pourra-t-elle être
exploitée ? On peut citer quelques pistes :

• L'identification accélérée, et presque industrielle,
  de facteurs de différenciation au moyen d'un système, aujourd'hui
  disponible, de criblage et de détection comparable à celui des
  biopuces.
• L'établissement de lignées embryonnaires mutantes à
  partir de tout jeunes embryons mis à l'écart dans le cadre de
  la fécondation in vitro lorsqu'ils sont porteurs de mutations
  délétères. Ces lignées devraient permettre de
  mieux comprendre et de mieux soigner ces maladies génétiques,
  et peut-être un jour de les guérir.
• On a identifié chez la souris le gène-maître nanog
  qui, actif dans les cellules souches embryonnaires, déclenche leur
  multiplication indéfinie tout en interdisant leur différenciation.
  Des cellules embryonnaires totipotentes, mises au contact du produit
  de ce gène, pourraient donc bientôt fournir - et de façon
  très économe car à partir d'un seul embryon - des millions
  de leurs semblables. Et si l'on parvenait un jour à réactiver
  ce gène chez des cellules souches adultes, elles seraient ramenées
  à leur état totipotent, c'est à dire à
  une nature de cellules embryonnaires et le problème éthique
  soulevé par l'utilisation des embryons humains ne se poserait plus.

Les récents résultats de la recherche dans le domaine des cellules
souches permettent d'envisager leur utilisation prochaine dans un but thérapeutique.
Les limites de cette révolution médicale ne seront pas seulement
dictées par celles de la science mais aussi par des réponses aux
questions éthiques qu'elle soulève. Un débat faisant intervenir
tous les acteurs de la société est en cours, et la récente
mise au point législative sur le sujet n'en marque pas le terme. Nul
doute que dans le domaine de l'utilisation des cellules souches, les limites
du possible continueront à être définies en fonction du
progrès des connaissances, mais aussi de l'évolution de la société.

http://www.snv.jussieu.fr/vie/bib/dos-doc/1documents.htm 

 

 

La lecture du programme officiel

et de ses commentaires peut se traduire

par l'arbre suivant :

 


comparaison programme officiel // cladistique "Classification phylogénétique du vivant", H

Le Gyuader et G Lecointre, Belin, 2002

: Les chimpanzés sont inclus dans les Homininés et non dans les hominidés

comparaison programme officiel // Nomenclature Américaine : les Hominidés excluent les singes; les

Homininés ne contiennent qu'Homo

 

La protéine Hox A1 s'exprime dans le tube neural
(future moëlle épinière), chez le jeune embryon. Son expression
s'étend depuis le rhombencéphale (ce qui correspond aux futurs
cervelet et bulbe rachidien) jusqu'à la partie la plus postérieure
du tube neural :

Les souris ayant les deux copies de ce gène inactivées
meurent à la naissance, et présentent de graves défauts,
en particulier : un retard de fermeture du tube neural, l'absence de certains
nerfs craniaux et de certains ganglions, une malformation de l'oreille interne
et des os du crâne (Dolle et al. et Carpenter et al., 1993).

Or ces structures sont formées par des cellules qui
quittent la face dorsale du tube neural au cours du développement : les
cellules de crête neurale. On peut donc conclure que le gène Hox
A1 a pour rôle, au cours du développement embryonnaire des vertébrés,
de spécifier la position de certaines cellules de crête neurale
le long de l'axe antéropostérieur. En l'absence de Hox A1, l'absence
ou l'insuffisance de ces cellules provoque les défauts observés.

Remarques : Hox A1 ne semble, d'après ces résultats, jouer
un rôle qu'au niveau de son expression la plus antérieure. De
même, Hox A1 semble affecter essentiellement les cellules de crête
neurale neurogéniques (qui donnent des neurones, et quelques autres
structures), mais pas les cellules de crête neurale mésenchymateuses
(qui ont un autre devenir) : celles-ci, dans cette région du cerveau
postérieur, sont affectées par l'absence du gène Hox
A3...

 Les protéines hHox-A1 (Homme) et mHox-A1 (souris) sont
remarquablement conservées : 92 % d'homologie de séquence.
Ces deux protéines ont un poids moléculaire d'environ 35 kiloDalton.

Les gènes Hox A1 de vertébrés sont considérés
comme étant les homologues du gène homéotique labial
de la drosophile (Drospohila melanogaster). La comparaison de la
protéine Labial avec Hox A1 (de souris ou d'Homme) montre une homologie
de séquence de 23 %, ce qui confirme que ces gènes (d'Homme, de
souris et de drosophile) dérivent d'un même gène ancestral.
En particulier, on retrouve chez ces trois gènes le même domaine
de fixation à l'ADN. Il est semblable (séquence protéique)
à 85 % entre la drosophile et l'Homme ou la souris. Ceci permet
de confirmer la rôle fondamental de ce domaine dans la fonction de cette
protéine.

On retrouve le même domaine de fixation à l'ADN chez les
3 protéines hHox-A1, mHox-A1 et Labial.

http://www.snv.jussieu.fr/vie/bib/dos-doc/1documents.htm 

http://www.snv.jussieu.fr/vie/bib/dos-doc/1documents.htm

L'Y humain mesure 1/3 de la taille de l'X et contient environ 10 fois moins de gènes

les régions pseudoautosomales ou PARs

Situées aux deux extrémités de l'Y, elles couvrent 5% de sa longueur. Représentées
également sur les deux extrémités de l'X, elles permettent l'appariement de ces deux partenaires lors
de la première phase de la méiose, au cours de laquelle a lieu le processus de recombinaison homologue, gage
de brassage génétique et de réparation de l'ADN.
Dans ces deux régions l'X et l'Y ne divergent pas, les mêmes 29 gènes codant des chaînes polypeptidiques
y sont représentés.

la région située entre les deux PARs

Elle représente 95% de la longueur de l'Y, dont sur le grand bras une large part d'hétérochromatine
compacte, très riche en séquences répétées, et considérée jusqu'ici comme
inerte. Pour le reste, elle contient 78 gènes codant des chaînes polypeptidiques. Parmi ceux-ci, certains codent
des chaînes polypeptidiques que l'on trouve exprimées chez les femmes, preuve qu'il existe d'autres zones d'homologie
entre l'X et l'Y que les PARs. A l'inverse, d'autres gènes n'existent que sur l'Y, parmi lesquels le gène
SRY (sex determining region Y) qui joue un rôle central.

Car avec l'équipement chosomosique XX vous êtes femme, et avec XY vous êtes homme : telle est la règle
habituelle. Mais la situation peut passablement se compliquer en cas d'anomalies chromosomiques : ainsi vous êtes
homme si vous êtes porteur de l'anomalie chromosomique XXY (l'une des anomalies génétiques les plus
fréquentes avec une moyenne de une fois sur 500 à 1000 naissances d'enfants de sexe masculin)... et femme
parfois bien qu'étant XY (par absence du gène SRY [Y non virilisant] ou absence du gène du récepteur
à la testostérone [porté par le chromosome X])... ou bien homme en étant XX (gène SRY
présent sur le chromosome X par anomalie de recombinaison)...
Signalons toutefois que les porteurs de telles anomalies chromosomiques ont souvent des désordres plus ou moins importants.
Ainsi, la majorité des porteurs de XXY développent le syndrome de Klinefelter (stérilité, faible
production de testostérone, faible pilosité, développement de seins vers 50 ans, etc...). Les femmes
XY liées à un Y non virilisant n'ont pas d'anomalie visible mais des ovaires incomplètement développés,
celles liées à l'absence de récepteur à la testostérone ayant des testicules intra-abdominaux.
Les hommes XX développent le syndrome de Klinefelter.

En réalité tout repose sur la présence ou non du gène SRY. Ce dernier a été localisé
en 1990 sur le petit bras de l'Y, juste à proximité de la région pseudo-autosomale. La protéine
qu'il code a pour effet de masculiniser en testicules les gonades jusque là indifférenciées du jeune
embryon. Les testicules formés, par l'intermédiaire de la testostérone qu'ils sécrètent,
contrôlent la mise en place des caractères sexuels secondaires masculins et la formation du sperme.

Pour autant, le sexe femelle n'est pas le résultat d'un programme par défaut puisque plusieurs gènes
sont nécessaires à la mise en place des caractères sexuels féminins, dont le gène DAX1
situé sur l'X. Chez le mâle, ce dernier est d'ailleurs inhibé par la présence du gène
SRY.

En fait, et d'une façon générale, le déterminisme sexuel chez les êtres vivants est varié :

• contrairement aux animaux, les plantes à fleurs sont pour la plupart hermaphrodites;
• chez la drosophile, les femelles sont également XX et les mâles XY, mais le sexe mâle provient de
  l'absence d'un autre X et non de la présence d'un Y;
• chez les serpents, les oiseaux, les papillons, la situation est inversée (ZW chez les femelles, ZZ chez les
  mâles) sans que l'on sache si c'est la présence du W qui détermine le sexe femelle ou la duplication
  du Z qui produit le sexe mâle;
• quant aux tortues, aux crocodiles, ils ne possèdent pas de chromosomes sexuels, et c'est la température
  à laquelle se développent leurs oeufs qui oriente l'embryon vers le sexe mâle ou femelle...

une origine autosomale

Les chromosomes sexuels furent d'abord une paire d'autosomes tout à fait ordinaires d'environ un millier de gènes,
quand, il y a environ 300 millions d'années (Ma), une mutation dans le gène SOX3 produisit le gène
SRY. Le proto-Y naissait alors, tandis que son partenaire toujours porteur de SOX3 devenait le proto-X. Les ancêtres
des marsupiaux monotrèmes pondeurs d'oeufs (représentés aujourd'hui par exemple par l'Ornithorynque)
sont les premiers Mammifères à avoir acquis le gène SRY sur leur proto-Y.

des inversions, des transpositions

Puis ces chromosomes ont été le siège d'une succession d'accidents:

• des inversions se sont concentrées sur l'Y, en dehors des extrémités (qui deviendront des PARs),
  empêchant dans ces régions les chromosomes X et Y de s'apparier, de se recombiner et donc de se réparer.
  Si la pression de sélection a conduit à la conservation de SRY (qui n'est pas sur les PARs), à l'inverse
  beaucoup de gènes sont devenus ainsi non fonctionnels (pseudogènes) ou se sont même perdus.
• des transpositions de fragments d'autosomes se sont produites il y a 130Ma à la fois sur l'X et sur l'Y, qui
  ont rallongé ces chromosomes leur permettant à nouveau de se réparer partiellement.
• elles ont été suivies d'inversions sur l'Y qui le rognaient derechef.
• enfin, il y a 30Ma une expansion autosomale sur le seul Y lui a apporté le gène DAZ, gène dont
  la délétion provoque l'azoospermie.

Au terme de ces tribulations l'Y se ratatine, passant par exemple chez l'Homme de un millier à environ 100 gènes.
D'aucuns allèrent même jusqu'à pronostiquer sa disparition totale d'ici 10Ma...

les séquences de l'Y

2003 - David Page et ses 39 collaborateurs du Massachussets Institute
of Technology (USA) ont présenté la séquence de presque toute l'euchromatine d'un Y humain,
comparée à celles de quelques fragments équivalents du Chimpanzé, du Bonobo et du Gorille, lesquels
ont divergé de la lignée humaine il y a environ 6 millions d'années. (voir refs 1
et 5). L'euchromatine de l'Y comprend trois types de séquences qui renseignent sur ce que fut l'évolution de ce
chromosome et sur les fonctions qui sont les siennes aujourd'hui :

 

• des séquences de l'X largement dégénérées, reliques des autosomes dont l'X et l'Y
  ont dérivé; elles comprennent encore 16 gènes fonctionnels qui s'expriment dans toutes les cellules
  des deux sexes,
• des séquences transposées récemment de l'X, il y a 3 à 4Ma, donc après la divergence
  de l'Homme et des Gorille, Chimpanzé, Bonobo; elles comprennent 2 gènes fonctionnels.
• des séquences acquises de diverses sources, puis amplifiées et pour cette raison nommées amplicons
  qui contiennent 60 gènes fonctionnels dont l'expression est restreinte au testicule.

amplicons et palindromes

Les amplicons ont pour caractéristique de contenir deux ou quelques copies de gènes très homologues
nécessaires à la fertilité mâle (voir une animation
sur le site du Howard Hughs Medical Institut. La réf. 4 propose d'autres animations).

Ils sont bordés de séquences en miroir dont les deux éléments rassemblés constituent
un palindrome, c'est à dire une séquence d'ADN qui se lit de la même façon dans les deux sens
par rapport à un point central - exemple: deux séquences rencontrées successivement, GGTAC, puis CATGG,
qui ensemble constituent le palindrome GGTAC.CATGG.

Le repliement l'une vers l'autre des deux séquences du palindrome produit une boucle qui met face à face
les copies de gènes très homologues de l'amplicon, dont l'une peut être mutée et l'autre pas.

Les échanges de séquences selon le mécanisme de conversion transforment la version mutée
en sa version non mutée, à l'intérieur même du Y donc, sans recours à la recombinaison
homologue.

Bien sûr, peut à l'inverse se produire la conversion du gène non muté en son équivalent
muté; mais on présage que cette double mutation court fort le risque d'être éliminée par
sélection.

L'avenir du chromosome Y humain n'est donc, pour l'instant, pas si sombre que le prédisaient certains! Pas plus
d'ailleurs que celui des Gorille, Chimpanzé et Bonobo chez qui des palindromes-amplicons similaires sont également
à l'oeuvre - l'hypothèse la plus simple étant donc d'estimer que ces ensembles sont apparus avant la
divergence des lignées humaine et simienne (ref. 6).

Conclusion

L'histoire de l'Y humain, porteur notamment du gène SRY déterminant le sexe mâle, n'est pas de tout
repos:

En 300 millions d'années, il a perdu les deux tiers de sa taille; les inversions qu'il a connues à plusieurs
reprises lui ont permis de garder le gène SRY sans le céder à son compagnon X, mais elles ont empêché
en même temps de réparer maintes mutations sur d'autres portions de l'Y qui, dégénérant,
ont été perdues, contribuant ainsi à le faire rétrécir (même si des transpositions
autosomales ou provenant de l'X l'ont parfois un peu rallongé).

Mais malgré ce parcours mouvementé, le chromosome Y humain a fait la preuve de sa résistance: celle-ci
est due à l'existence de palindromes-amplicons qui lui donnent la possibilité de corriger "en interne"
les mutations qui affectent la fertilité mâle.

Résistance encore plus forte qu'on ne le pensait: le groupe de David Page a montré, en septembre 2005, que
les gènes situés en dehors de ces zones résistaient mieux aux mutations chez l'Homme que chez le Chimpanzé
(ref 7).

L'avenir de l'Y humain est-il assuré pour autant? Le campagnol-taupe d'Arménie Ellobius lutescens
nous enseigne que non, lui qui a perdu son Y et son gène SRY. Mâles et femelles devenus XO (le zéro
indique l'absence de X ou de Y), sont pourtant parfaitement viables : chez le mâle, un autre gène, sur un autre
chromosome, a dû prendre la relève de SRY ou de l'un des gènes sous sa commande.

L'histoire de l'Y n'est pas celle d'un long fleuve tranquille.

 VI. Bibliographie

1. Le chromosome Y humain Charmot-bensimon
   D. et Dudley K. Documents de cours (2005-2006) du Master BBSG de l'Université de la Méditerranée
   Aix-Marseille II .
2. Sex chromosomes
   Kimball J.
3. La femme est l'avenir de l'homme. La Recherche juillet 2004.
4. Page regroupant plusieurs animations
   sur le chromosome Y sur le site du Howard Hughs Medical Institut.
5. The
   male-specific region of the human Y chromosome is a mosaic of discrete sequence classes. Skaletsky et coll. (2003)
   Nature 423(6942):825-837.
6. Abundant
   gene conversion between arms of palindromes in human and ape Y chromosomes. Rozen S. et coll. (2003) Nature 423(6942):873-876.
7. Conservation
   of Y-linked genes during human evolution revealed by comparative sequencing in chimpanzee. Hughes J.F. et coll. Nature
   (2005) 437(7055):100-103.

http://www.snv.jussieu.fr/vie/bib/dos-doc/1documents.htm 

La maladie des enfants-bulle est une maladie très rare : 5/100 000 naissances / année en France.

Elle
se manifeste par un déficit immunitaire sévère, qui condamne
les jeunes malades à vivre à l'abri des germes dans une atmosphère
stérile, d'abord à l'intérieur d'une bulle de plastique,
puis d'un local spécialisé (et d'un scaphandre pour leurs sorties).

Dans sa variante la plus connue, ce déficit est dû à la
présence sur le chromosome X d'une version mutée d'un gène
codant pour une protéine participant à la constitution du récepteur
de l'interleukine 2 (la sous-unité gamma-c) sur la membrane de certains
globules blancs. L'absence du récepteur complet rend impossible l'orchestration
entre eux des globules blancs lymphocytes T (LT), lymphocytes B (LB) et lymphocytes
Natural Killer (NK) par le moyen de l'interleukine 2.

Les garçons, qui
ne disposent que d'un seul chromosome X, deviennent ainsi sujets à toutes
les infections. La maladie des enfants-bulle est donc en fait, dans sa variante
la plus connue, la maladie des garçons-bulle ou "déficit
immunitaire combiné sévère lié au chromosome X"
(DISC-X, voir Fig. 1).

 

Les seules perpectives de soin pour ces petits garçons sont

• soit une
  greffe de moelle osseuse, tissu qui est à la source des globules blancs, mais les donneurs de moelle compatibles sont rares.
• soit une thérapie génique qui apporte le gène non muté, mais la thérapie génique
  est interrompue actuellement par des problèmes majeurs :
  

1999 - les premiers essais de thérapie génique, conduits
par l'équipe d'Alain Fisher à l'hopital Necker, débutent
par un spectaculaire succès - qui est aussi le premier jamais obtenu
par thérapie génique : dix enfants sont traités, et guérissent.
Les cellules souches de leurs globules blancs avaient été prélevées
dans leur moelle osseuse et traitées in vitro par un rétrovirus
désactivé qui ajoutait la version non mutée du gène
à leur génome porteur du gène muté. Ainsi complétées,
ces cellules souches avaient alors été réinjectées
dans la circulation sanguine des petits malades.

2002 - deux d'entre eux, qui avaient été
traités avant l'âge de trois mois, deviennent leucémiques.
L'un guérira, mais l'autre finira par en mourir. Les essais thérapeutiques
sont aussitôt suspendus. Dans les deux cas, le gène correcteur
s'est inséré au voisinage du même gène LMO-2 prédisposant
au cancer.

Les protocoles sont alors révisés : début du traitement
repoussé après l'âge de six mois, recours à des doses
plus faibles de cellules modifiées. Et les essais thérapeutiques
sont de nouveau autorisés en mai 2004.

2005 - un troisième cas de leucémie se déclare
en janvier chez un enfant traité à l'âge de neuf mois.
Les essais thérapeutiques sont une seconde fois suspendus. Le gène
médicament s'est à nouveau inséré auprès
d'un oncogène (qui n'est pas le LMO-2). Les essais ne reprendront à
Necker que lorsque le virus vecteur du gène salvateur aura pu être
modifié.

Parallèlement, en Grande-Bretagne les sept enfants traités selon
un protocole pratiquement similaire au premier protocole français sont
tous guéris. Cependant, le temps écoulé depuis le traitement
n'a pas encore atteint la durée à partir de laquelle les leucémies
françaises sont survenues. Enfin, des essais vont être conduits
pour la première fois aux Etats-unis. Ils s'adresseront aux enfants sur
lesquels une greffe de moelle osseuse a échoué ou n'a pu être
tentée.

C'est dans ce contexte qu'une nouvelle voie de thérapie génique
vient de commencer à être expérimentée. Cette nouvelle voie thérapeutique est due à Fyodor
D. Urnov et ses collaborateurs, de Sangamo BioSciences en Californie et
de l'Université Southwestern au Texas. Sa nouveauté fondamentale
est qu'elle opère par remplacement et non par addition, c'est à
dire que la portion mutée du gène a été précisément
remplacée par la version non mutée, sans toucher au reste du génome.
Dans le processus antérieur, la version non mutée du gène
était ajoutée à un génome qui demeurait porteur
de la version mutée d'origine.

Pour effectuer cette substitution, les chercheurs ont opéré sur
les LT prélevés chez les malades et ont réussi in vitro
l'admirable enchaînement suivant :

1. Détection du site précis de la mutation par des protéines
   en doigts de zinc.
2. Coupure de l'ADN ciblé par une enzyme (une endonucléase)
   préalablement liée à deux protéines en doigts
   de zinc.
3. Exploitation du mécanisme naturel de recombinaison homologue pour
   remplacer la portion du gène muté par la portion équivalente
   du gène non-muté.
   

Dans près de 20% des cas - un taux énorme pour une recombinaison
homologue, et un taux suffisant pour soigner plus tard les malades - la portion
d'ADN mutée des LT a été remplacée par sa version
non mutée. Le gène corrigé s'exprime sous forme d'ARNm,
puis de la protéine gamma-c permettant la bonne mise en place du récepteur
de l'interleukine 2. La correction s'effectue de façon rapide et se maintient
de façon durable.

Ultérieurement, ce ne sont pas les LT, LB ou NK que les chercheurs corrigeront
in vitro par cette méthode, mais leurs cellules souches progénitrices
logées dans la moelle osseuse qui bénéficient d'une longue
durée de vie. Une fois traitées, elles seront réinjectées
dans la circulation des petits patients pour pouvoir coloniser leur moëlle
osseuse.

Conclusion

Cette nouvelle voie de thérapie génique est riche de promesses
parce qu'elle pourrait, sans affecter le reste du génome, et sans risquer
notamment de perturber un oncogène, corriger de façon parfaitement
ciblée la version indésirable d'un gène. A la condition
toutefois que puisse être garantie l'absolue spécificité
de la méthode vis à vis du gène à corriger, ou encore
l'absence de réactions immunitaires provoquées par les protéines
en doigts de zinc qui sont les artisans de ce ciblage.

Il deviendrait alors possible d'étendre cette technique à d'autres
maladies, car c'est aujourd'hui toute une batterie de ces protéines en
doigts de zinc que les chercheurs savent fabriquer à la demande, et qui
sont à chaque fois capables de reconnaître une cible différente
: qu'il s'agisse du gène muté dans le cas d'autres maladies monogéniques,
comme par exemple l'anémie falciforme, ou qu'il s'agisse du gène
à faire muter, comme celui codant la porte d'entrée du virus du
Sida à l'intérieur des LT !

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Les doigts de zinc (voir fig. 2A) sont des structures de reconnaissance de
l'ADN. En fonction de la nature des acides aminés qui les composent
(hors les cystéines et histidines liant l'atome de zinc), une séquence
spécifique d'ADN de trois nucléotides sera reconnue. En utilisant
deux protéines comportant chacune trois doigts de zinc pouvant être
individuellement choisis (voir fig. 2B), la reconnaissance s'effectue sur
une séquence spécifique de dix-huit nucléotides. Un rapide
calcul de probabilité établit qu'une séquence aléatoire
de dix-huit nucléotides n'a pratiquement aucune chance d'exister à
plus d'un exemplaire dans un génome de cinq miliards de nucléotides
correspondant au génome humain. En conséquence, par cette méthode
on peut cibler de manière spécifique et unique une séquence
d'intérêt connue (par exemple un gène muté...)

Figure 2A : schéma d'une structure en doigt de zinc. Un atome de zinc central stabilise le repliement de la protéine en établissant quatre liaisons avec deux résidus cystéine et deux résidus histidine. On trouve également des structures en doigt de zinc faisant intervenir quatre résidus cystéine. Source illustration : Wikipedia (article Zinc finger), dépendante de la Licence de documentation libre GNU.

Figure 2B : schéma d'une ZFN (Zinc Finger Nuclease). Chaque doigt de zinc reconnaît trois nucléotides spécifiques. Une protéine comportant trois doigts de zinc en tandem permet donc de reconnaître une séquence spécifique de neuf nucléotides. A ce domaine de reconnaissance, on a couplé le domaine endonucléasique de l'enzyme Fok I.

L'endonucléase utilisée (domaine endonucléasique de l'enzyme
Fok I) est non spécifique et agit sous forme dimérique. On utilise
donc deux protéines comportant chacune trois structures en doigt de
zinc reconnaissant des séquences éloignées de quelques
nucléotides. La liaison des deux protéines en doigts de zinc
sur leurs séquences respectives rapproche les deux endonucléases
qui leur sont associées. Ce rapprochement permet leur dimérisation
et par suite la coupure de la molécule d'ADN (voir fig. 3).

Figure 3 : coupure de l'ADN après dimérisation du domaine nucléasique de Fok I. Chaque ZFN reconnaît une séquence de neuf nucléotides séparés par six nucléotides, un espace nécessaire pour l'action de l'endonucléase. Cette action n'est possible qu'après dimérisation de cette dernière.

 

La courte molécule d'ADN non mutée, susceptible de remplacer
la fraction mutée à l'origine de la maladie, est ajoutée
aux deux molécules protéiques précédentes (voir
fig. 4). Si le phénomène de recombinaison homologue (largement
utilisée dans la technique d'inactivation de gène, plus connue
sous le nom de knok out) ne nécessite pas une coupure préalable
de l'ADN par endonucléase, son efficacité dans ces conditions
est très faible. Couper l'ADN permet d'augmenter considérablement
le taux de recombinaison homologue.

Figure 4 : la recombinaison homologue. La molécule d'ADN ajoutée comporte le gène non-muté à insérer encadré de séquences flanquantes identiques aux séquences qui bordent le site de coupure par l'endonucléase. La recombinaison se produit de façon spontané