• 4- Le maintien de l'intégrité de l'organisme : quelques aspects de la réaction immunitaire

    A9/ Séparation des anticorps / électrophorèse

    Manuel doc.2p.299

    http://www.jeulin.fr/fr/a-a1023722-edc1000005/ressource/1001176/TP-Electrophorese-de-serums-de-lapin-immunise-ou-non-immunise-contre-un-antigene.html

    http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/ATP/bioch2.htm

    http://www.didier-pol.net/2elphser.jpg

    http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/ATP/bioch4.htm

    http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/ATP/bioch6.htm

    Nous avons mis en évidence la spécificité de la réaction anticorps-antigène. Les anticorps anti-BSA présents dans le sérum immunisé se fixent de façon spécifique à la BSA = agglutination. Cette expérience montre qu'il y a synthèse d'anticorps lors des processus d'immunisation. Ces anticorps sont présents dans le sérum. L'électrophorèse permettra de détecter des protéines absentes dans le sérum non immunisé et présentes dans le sérum immunisé : les anticorps. A un pH basique, les protéines sont chargées négativement et se dirigent vers le pôle positif (anode) plus ou moins rapidement selon leur charge électrique. Les protéines seront donc séparées.

     

    Matériel :

    6 ou 7 groupes, 6 ou 7 bandes d’acétate de cellulose, 6 bacs de décoloration avec au moins 4 compartiments, 4 papiers filtre par groupe, tampon véronal, rouge ponceau, aide acétique à 5%, 4 cuves à électrophorèse, chiffon, sérum de lapin immunisé, sérum de lapin non immunisé

    Protocole expérimental

     

    1. Remplir chaque compartiment de la cuve à mi-hauteur avec du tampon véronal à pH 9,2, de sorte que les électrodes soient recouvertes. Prévoir environ 100 mL de solution par cuve.

    2. Professeur : Immerger une bande d'acétate de cellulose dans une solution de tampon véronal pendant 10 minutes dans un bac de décoloration (une par compartiment). Ne pas les superposer.

    3. Professeur : Les sortir à l'aide d'une pince plate, les placer entre deux feuilles de papier filtre et les sécher à l'aide d'un mouvement rapide de la main.

    4. Mise en place des bandes d'acétate de cellulose dans la cuve :

    Une cuve est en mesure d'accepter trois bandes au maximum. Orienter la cuve de telle sorte que le pôle négatif (cathode) soit vers vous.

    Fixer ces bandes sur leur portoir sans mettre les doigts dessus, en les tendant le plus possible avec précaution. Ecarter les cales du support de bandes, en les faisant pivoter. Placer le coin coupé de la bande du coté cathode (pôle négatif) à droite de telle sorte que la surface mate, surface absorbante soit disposé vers le haut. Faire glisser chaque extrémité de chaque bande entre les cales et leur support. Rabattre les cales. Tendre légèrement les bandes en tirant sur leurs extrémités libres à l'aide de la pince plate. Les bandes doivent être parallèles entre elles et perpendiculaires à l'axe du portoir pour permettre une migration des protéines dans l'axe de la bande.

    5. Puis mettre le portoir dans la cuve et vérifier que les extrémités de chaque bande trempent dans le tampon de chacun des deux compartiments.

    6. Tremper lapplicateur de sérum dans le sérum de lapin immunisé et l'appliquer perpendiculairement au grand axe de la bande sur la bande à 15 mm du bord ( à partir des cales), côté cathode (pôle négatif). Lapplication doit être faite de telle sorte que lon puisse mettre deux traces de sérum lune à côté de lautre.

    7. Répéter l'opération sur la même bande avec le sérum de lapin non immunisé en plaçant à côté de lapplication précédente.

    8. Laisser migrer l'électrophorèse pendant 45 minutes environs. (160 V)

    9. Coloration : Retirer les bandes et les immerger dans une solution de rouge ponceau pendant 1O minutes. (ne pas les superposer.)

    10. Procéder à la décoloration : Tremper les bandes colorées dans 3 bains différents d'acide acétique à 5 % pendant 2 minutes dans chacun des bains.

    11. Sortir la bande du dernier compartiment et la sécher sans frotter entre deux feuilles de papier filtre.

    12. Observer.

    13. Lecture à laide du lecteur délectrophorégramme.

     

    • Principe

    La séparation et l'identification de protéines par électrophorèse de liquides biologiques est utilisée en immunologie, notamment pour confirmer le diagnostic de certaines atteintes du système immunitaire, en particulier celles concernant l'immunité humorale. 
    Des pathologies rares affectant la production des anticorps comme l'agammaglobulinémie, absence de sécrétion des gammaglobulines et l'hypogammaglobulinémie, sécrétion insuffisante des gammaglobulines, peuvent être détectées par électrophorèse des protéines sériques. En effet, à de rares exceptions près, les atteintes de l'immunité humorale se traduisent par une diminution de la concentration d'une ou plusieurs classes d'immunoglobulines dans le sérum même si les larges variations de concentration observées parmi la population adulte rendent difficile la détermination de la fourchette des valeurs normales. C'est pourquoi, en pratique clinique, d'autres tests sont utilisés pour compléter l'information du médecin comme, par exemple, la mesure des isohémagglutinines et de l'anti-streptolysine O ou celle des agglutinines typhoïdiques H et O avant et après immunisation par le vaccin contre la fièvre typhoïde. 
    A l'inverse, le profil électrophorétique du sérum montre une importante augmentation de la bande des gammaglobulines chez les patients et les animaux atteints de myélome (tumeur maligne des plasmocytes) avec notamment un pic dit "M" (monoclonal) dans cette région dont la nature peut être confirmée par immunoélectrophorèse. L'électrophorèse du sérum  constitue ainsi une méthode de choix pour le suivi des patients atteints de gammapathies monoclonales. En outre, le composant M peut être détecté dans beaucoup d'autres pathologies comme les leucémies chroniques à lymphocytes, les lymphomes ayant pour origine des lymphocytes B ou T, dans quelques cancers, dans diverses atteintes dégénératives (cirrhoses) et parasitaires et dans des maladies autoimmunes comme la polyarthrite rhumatoïde. Selon la pathologie, la nature du composant M est variable, molécules d'anticorps intactes ou altérées, fragment d'anticorps, chaînes lourdes ou chaînes légères isolées. Dans le myélome, non seulement le profil électrophorétique du sérum présente un pic M dit en "clocher d'église" dans la région des gammaglobulines, mais, de plus, on retrouve souvent ce composant dans l'urine (protéines de Bence-Jones). Au contraire, dans les gammapathies monoclonales bénignes ou d'origine incertaine, le pic M est moins marqué et on ne retrouve pas ces protéines dans l'urine.
    Si d'autres examens sont nécessaires en clinique pour établir un diagnostic sûr, l'électrophorèse de sérums humains artificiels peut néanmoins être utilisée à des fins pédagogiques pour concrétiser les connaissances sur l'immunité humorale d'autant qu'elle peut aussi servir à comprendre les notions de réponses primaire et secondaire à une infection et les mécanismes de la protection vaccinale. 
    Les sérums utilisés dans ce cadre sont constitués avec des produits du commerce. On trouve ainsi du sérum dépourvu des trois classes d'immunoglobulines A, G et M permettant de mimer un dysfonctionnement de l'immunité humorale, des IgG permettant d'enrichir un sérum et/ou une urine artificielle pour mimer divers types de situations physiologiques ou pathologiques accompagnées d'une augmentation des anticorps (vaccination, réponse secondaire, myélome) ainsi que divers sérums animaux immunisés ou non. 
    On peut ainsi poser divers problèmes qui seront résolus par l'analyse des électrophorèses.

     

    Le logiciel « Activité électrophorètique » traduit une bande d’électrophorèse en électrophorégramme en utilisant l’adapteur-lecteur d’électrophorèse. Il rend possible le traitement quantitatif de l’électrophorégramme réalisé.

     

    Protocole :

    Préparation de lacquisition

    Brancher le fil de l’interface avant d’ouvrir le logiciel.

    Lancer le logiciel « atelier scientifique ».

    Choisir l’interface visio/ visio + ; OK ; activité électrophorétique. Si une anomalie est détectée, vérifier les branchements.

    Il vous sera peut-être demandé d’indiquer la longueur de la bande, ce qui optimise la lecture.

    Pour cela : -mesurer la longueur de la bande

    -ouvrir le menu Acquisition, puis longueur de bande

    -indiquer cette longueur, arrondie au cm supérieur et valider.

     

    Préparation du matériel

    Vous avez à votre disposition deux bandes d’électrophorèse scotchées sur la paillasse. Ne pas les enlever.

    (Disposer la bande d’électrophorèse sur la feuille de papier blanc et la recouvrir de la feuille transparente.)

    Positionner le front du lecteur à la limite supérieure avant la première tache située à l’opposé de l’encoche, centré sur la bande à lire. Pour vous guider, positionner éventuellement, la règle le long du lecteur pour guider un déplacement de la souris parallèle à la bande.

     

    Acquisition de lélectrophorégramme

    Lancer l’acquisition, puis déplacer le lecteur d’électrophorèse d’un mouvement régulier, de préférence en le tirant. L’écran affiche la densité de coloration au cours du déplacement. A la fin, après avoir arrêté ou validé l’acquisition, le tracé de l’enregistrement se cale plein écran et affiche la densité optique de la bande.

     

    Traitement de l’électrophorégramme

    Le logiciel peut calculer les quantités de substances correspondant à chaque pic. Mais pour cela, l’utilisateur doit indiquer des repères qui sont la ligne de base et les limites de pics

     

    Sélection de la portion à étudier

    A l’aide du bouton zoom sélectionner la portion de l’électrophorégramme qui sera traité. C’est elle qui apparaîtra à l’impression. La surface à agrandir se définit en traçant une zone de sélection avec la souris.

     

    Définition de la ligne de base

    Cette ligne indique au logiciel le niveau à partir duquel il calcule les surfaces des pics. On élimine la portion basse de l’enregistrement qui correspond à la densité optique du support.

    Cliquer sur le bouton ligne de base, déplacer la ligne horizontale avec la souris et cliquer sur le bouton gauche pour la fixer à l’endroit choisi.

     

    Définition de la limite des pics

    Cliquer sur le bouton « séparation », déplacer la ligne verticale avec la souris et cliquer sur le bouton gauche pour la fixer à l’endroit choisi. Définir ainsi en abscisse, les limites droite et gauche de chaque pic, à l’aide des documents joints. Repérez les différentes substances et leur quantité respective. Valider les séparations.

     

    Un tableau s’affiche. Par défaut, les quantités de substance sont exprimées en pourcentage de la quantité totale.

    On peut aussi demander le calcul et l’affichage des valeurs brutes exprimées en unités arbitraires, des pourcentages de chaque composant.

    Sauvegarde

    Pour une sauvegarde définitive, utiliser le bouton « Enregistrer »

    Annotations (compte-rendu)

    Dans le tableau il est possible de nommer les pics dans les zones de texte placées en face des valeurs calculées. Elles apparaîtront dans le tableau à l’impression.

    Sur le graphique il est possible d’annoter les pics avec des traits de rappel sur le graphique. Elles apparaîtront sur le graphique imprimé.

    Impression

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